Винарство

Што претставува охратоксин А во виното и метод за негово одредување

Охратоксин А (ОТА) е вид на секундарен метаболит кој ја контаминира храната и добиточната храна. ОТА е нефротоксичен, хепатотоксичен и имунотоксичен кај експерименталните животни, и поради неговите канцерогени својства, Меѓународната агенција за истражување на ракот (IARC) го оцени OTA како можен канцероген и кај луѓето. 

ОТА е пронајден и во други стоки од животинско и растително потекло, како: кафе, зачини, билки,
какао, грозје, месо, млеко, сокови, пиво и вино. 

ОТА е чест загадувач на виното и се покажало дека поголема изложеност на ОТА кај луѓето е поврзана со потрошувачката на црвено вино. 

Генерално, црвените вина содржат повеќе ОТА од розе и белите вина поради различни постапки за производство на вино. 

Некои резултати покажуваат дека вината од jугот содржат повеќе ОТА отколку оние од север, барем во Европа и Северна Африка. Оваа разлика се должи на климатските услови, условите за одгледување на грозје и складирање. 

Метод (I) за одредување на ОТА во виното

Подготовка: Раствор на ОТА се приготвува со  растворање на 5 mg кристален ОТА во 4 ml од смесата толуен-оцетна киселина 99: 1 (v / v). Овој раствор се чува на -18 ° C. Калибрацијата се подготвува чекор по чекор со вакуум испарување до потребниот волумен на растворот, растворање на остатокот во мобилната фаза и секвенцијално разредување на овој раствор. Сето ова  се чува на температура од 4 ° C.

Апаратура: HPLC опремата Agilent Technologies 1100 серија (Heilbronn, Германија) е со автоматски примерок и детектор за флуросценција на бранова должина од 333 nm и емисија на бранова должина од 460 nm. Аналитичката колона Zorbax SB-C18, 250 × 4.6 mm со големина на честичките од 5 микрони заедно со предколоната Zorbax SB-C18, 12,5 х 4,6 милиметри, со иста големина на честичките (Agilent Technologies, Halbron,Германија). Мобилната фаза се меша со 20 ml раствор на оцетна киселина во 1000 ml дејонизирана вода 50:50 (v / v) и се пренесува преку системот по стапка од 1 ml.min-1. Примерокот се пренесува преку аналитички колона со волумен од 100 микролитари. Сите анализи се вршaт на собна температура.

Идентификација на ОТА: ОТА е идентификуван врз основа на времето на задржување, на крајот преку спектри на флуоресценција во опсег на бранова должина од 365 до 435 nm.

Потврда на методот: Оваа  постапка е интерно потврдена со помош на Калибрација и евалуација на опсегот на линеарноста, прецизност, границата на детекцијата (LOD) и квантификација (LOQ), обновување и проширување на несигурност на мерките за вино и сок од грозје. Мерењата на калибрација се врши со помош OTA стандардни раствори. Линеарна реакција на флуоресцентен детектор е утврдено во опсег на концентрации 0,032-3,125 μg.l-1, што доведува до корелација фактор Р> 0,999. Репродуктивноста изразена како повторливост беше прекината на две нивоа на концентрација ОТА: 0.35 и 2.61 μg.l-1 со вино, а концентрацијата 0.25 и 2.54 μg.l-1 со сок од грозје. LOD и LOQ се пресметува со користење на равенката:

LOD = X0 + 3SD и LOQ = X0 + 5SD,  (каде X0 е просечниот одговор на празни примероци, SD стандардна девијација за n = 6). За надоместување на ОТА со користење на IAC колоните како примерок за предтретман се испитувани вина со стандардни раствори на ОТА со нивоа од 0,18 и 2,44 μg.l-1, како и сок од грозје со ниво од 0,21 и 2,50 μg.l-1. Мерењето на несигурност е утврдена со комбинација на несигурност (УЗ) со што го опфаќа факторот k = 2 (на пример 2Uc) и 95% интервал на сигурност.

Контрола на квалитетот: Стабилноста на калибрационата крива е проверена во две одредени точки постигнувајќи пад на  кривата на калибрација. За таа цел за контрола на ОТА (0.25 μg.l-1 и 2.10 μg.l-1) се користат стандардни решенија за составување на една контролна табела со ограничување на горните и долните контролни линии од ± 2 SD (n = 9).

Метод (II) за одредување на ОТА во виното

Подготовка: Раствор на ОТА се подготвува во метанол (1.0 mg ML-1). Концентрацијата на раствор е утврдена спектрофотометриски на 333 nm со 6640 L mol-1 cm-1, како коефициентот на исчезнување. Се подготвува со додавање на веќе одредени количини на разреден раствор од мобилната фаза на HPLC за да се добие конечна концентрација од  0,5-10,0 ng т-1 ОТА. Овој раствор свежо се приготвува секој ден. Точно определен дел или 10,0 ml од винскиот примерок (црвено или бело вино) е разреден со 10,0 ml на фосфатен пуфер тампон. По прилагодувањето на  pH вредноста на 7,0-7,5 со 10 mol L-1 NaOH, примерокот е филтриран преку микрофибер филтер хартија. Десет ml од филтратот се нанесува со имуноафинитетна колона (IAC; Ochra Тест, Викам, Watertown, м-р, САД). Колоната потоа се измива со 10,0 ml фосфатен пуфер тампон, а потоа со 10,0 ml HPLC-дестилирана вода. OTA растворот се извлекува од IAC-колона со користење на 4.0 ml метанол закиселен со оцетна киселина (98: 2) (V / V). Извлечениот раствор се собира и испарува се до сувост над пареата  на азотот. Пред да се анализира HPLC, испарените примероци се раствораат во 200 микролитари на мобилна фаза.

Апаратура: Опремата за HPLC состои од еквимоларна или изократска пумпа, манометриски модул, инјектор со 50 микролитар јамка, флуоресцентен детектор (термо поделба на производите – Spectra систем FL 2000) и внатрешен записник.  GUARD колоната и аналитичката колона се во обратна фаза (C18) (LiChrospher, Merck) со 5микрони честички (4.0×4.0 и 4.0×125.0 mm, соодветно).

Услови за HPLC: Мобилната фаза се состои од метанол, вода и оцетна киселина (700: 300: 20), pH 3.0, беше дегасирана пред употреба 15 минути во ултразвучен простор. Протокот е 0,5 ml min-1. бранова должина побудување на детектор на флуоресценција, поставен на 336 nm, а Брановата должина на емисијата е поставен на 464 nm. Волумен на вбризгување беше 50 микролитари, а анализите се врши на собна температура. Под овие услови, времето на задржување на ОТА e околу 8 минути.